Nghiên cứu sản xuất pyruvate từ vi khuẩn Halomonas với nguồn carbon từ rong biển Ulva của Việt Nam

Pyruvate là một axit α-oxocarboxylic quan trọng, đóng vai trò trung tâm trong quá trình trao đổi năng lượng ở cơ thể sống. Chúng được sử dụng làm nguồn nguyên liệu ban đầu cho quá trình sinh tổng hợp các dược chất như alanin, L-tyrosine, phenylalanine và L-tryptophan. Bên cạnh đó, chúng cũng được sử dụng trong quá trình sản xuất các thuốc bảo vệ thực vật, polymer, mỹ phẩm, phụ gia thực phẩm và thực phẩm chức năng. Gần đây, chủng vi khuẩn hoang dại Halomonas sp. KM-1 đã được chứng minh là có khả năng tổng hợp lượng lớn pyruvate tương đương với các chủng nấm men đột biến hoặc E. coli tái tổ hợp. Bên cạnh đó, do chi Halomonas thuộc nhóm sinh vật ưa muối với đặc điểm chịu được môi trường có nồng độ muối, pH cao nên khả năng tạp nhiễm trong quá trình nuôi thấp. Nhiều chủng có thể nuôi trồng trong các hệ thống lên men hở, liên tục và không cần khử trùng. Điều này cũng góp phần làm giảm chi phí sản xuất. Bên cạnh đó, nếu lựa chọn được nguồn carbon rẻ tiền sẽ giúp giảm giá thành nguyên liệu đầu vào.

Trong vài thập kỉ trở lại đây, rong biển thu hút nhiều sự quan tâm nghiên cứu như là một nguồn nguyên liệu có khả năng tái tạo trong sản xuất nhiên liệu sinh học và các sản phẩm khác. Rong biển với các lợi thế như tốc độ tăng sinh khối cao, không cạnh tranh với đất nông nghiệp như các thực vật trên cạn, không đòi hỏi phân bón, thuốc trừ sâu…, đặc biệt là thành tế bào không chứa lignin hoặc hàm lượng cellulose thấp nên chúng là nguồn nguyên liệu tiềm năng cho các quá trình tinh chế sinh học. Rong lục là những loài sống ở những vùng nước phú dưỡng, ven biển. Tế bào của chúng có chứa cellulose, tinh bột và các polysaccharides sulfate như ulvan. Do giá trị dinh dưỡng cao nên chúng thường được sử dụng làm thực phẩm hoặc nuôi trồng thủy sản. Gần đây, việc sử dụng chúng còn được mở rộng trong lĩnh vực nông nghiệp và sản xuất ethanol.

Việt Nam là quốc gia biển, rất đa dạng về các loài tảo lớn nên đây là cơ sở để nghiên cứu chọn ra các loài rong biển có hàm lượng carbohydrate cao, có thể chuyển hóa thành đường sử dụng để thay thế glucose trong môi trường nuôi cấy loại vi khuẩn này. Nếu các chủng Halomonas spp. có khả năng sinh trưởng trên nguồn đường từ quá trình thủy phân rong thì sẽ giúp nâng cao giá trị sử dụng của chi rong biển này trong việc sản xuất các chất hóa học có giá trị bên cạnh việc sản xuất ethanol. Ngoài ra, tính đến thời điểm đề tài được thực hiện, Việt Nam chưa có một công trình nghiên cứu nào đã công bố về việc sản xuất pyruvate từ các cơ thể sống. Trong khi đó, Việt Nam là nước có mức độ đa dạng sinh học rất cao với nhiều hệ sinh thái tự nhiên khác nhau. Do đó, có rất nhiều chủng, loài động thực vật, vi sinh vật đặc hữu với nhiều đặc tính sinh học quý.

Nhằm phân lập và lựa chọn được chủng Halomonas spp. bản địa có khả năng sản xuất pyruvate cao, có thể sử dụng nguồn carbon từ rong biển Ulva của Việt Nam. Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam do TS. Hoàng Thị Lan Anh đứng đầu đã tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu sản xuất pyruvate từ vi khuẩn Halomonas với nguồn carbon từ rong biển Ulva của Việt Nam”.

Sau một thời gian triển khai, nhóm đề tài thu được một số kết quả như sau:

- Đã phân lập có 18 chủng Halomonas spp. từ các mẫu đất, nước thu thập tại vùng biển/rừng ngập mặn thuộc tỉnh Hải Phòng, Thái Bình, Nam Định, Nghệ An, Khánh Hòa; và môi trường nuôi tảo Dunaliella tertiolecta có khả năng sản xuất pyruvate ngoại bào.

- Đã chọn được hai chủng tiềm năng là BL6 và C22 có khả năng tiết pyruvate ngoại bào cao hơn so với các chủng còn lại với hàm lượng pyruvate tương ứng là 25,38 và 28,16 g/L.

- Dựa các đặc điểm hình thái, sinh lý, hóa sinh quan trọng trong khóa phân loại của chi Halomonas, cũng như đọc và so sánh trình tự đoạn gen 16S rRNA, 2 chủng tiềm năng Halomonas sp. BL6 và Halomonas sp. C22 đã được xác định là loài Halomonas aquamarina và H. hydrothermalis.

- Nghiên cứu đặc điểm sinh học của hai chủng tiềm năng là BL6 và C22 đã cho thấy chủng BL6 có khả năng sinh trưởng và phát triển trên môi trường có nồng độ muối NaCl 0,1–20% (w/v) (tối ưu ở 5%), nhiệt độ 20-40°C (tối ưu ở 32°C), pH 6,0-12,0 (tối ưu pH 9). Chủng C22 có khả năng sinh trưởng và phát triển trên môi trường có nồng độ muối NaCl 0,1-10% (w/v) (tối ưu ở 5%), nhiệt độ 25-40°C (tối ưu ở 37°C), pH 6,0-12,0 (tối ưu pH 10).

- Đã tiến hành giải trình tự và lắp ráp de novo hệ gen của hai chủng vi khuẩn này. Bản draft genome của chủng BL6 gồm 3.720.962 bp với tỷ lệ G+C là 58,3%, N50 là 629,667 bp, chứa 3401 trình tự mã hóa (CDSs), 57 tRNA, 6 rRNA và 1 tmRNA, có khoảng 3465 trình tự mã hóa cho protein đã được dự đoán. Trình tự hệ gen nói trên đã được đăng kí 2 trên GenBank với mã số VDGL00000000, BioProject ID (PRJNA546082), BioSample ID (SAMN11951961). Bản draft genome của chủng C22 gồm 3.934.166 bp với tỷ lệ G+C là 60,2%, N50 là 580.246 bp, chứa 3600 trình tự mã hóa (CDSs), 58 tRNA, 9 rRNA và 1 tmRNA. Có khoảng 668 trình tự mã hóa cho protein đã được dự đoán. Trình tự hệ gen của C22 đã được đăng kí trên GenBank với mã số VBVC0100001.1- VBVC01000026.1, BioProject ID PRJNA543183, BioSample ID SAMN11656172.

- Đã nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy lên khả năng sản xuất pyruvate của hai chủng tiềm năng BL6 và C22. Chủng BL6 tổng hợp và tiết pyruvate ra môi trường đạt cao nhất sau 72h nuôi cấy (49,76 g/L) khi nuôi ở bình tam giác 250mL trong môi trường SOT có bổ sung 20% glucose, 3% NaNO3, nồng độ đệm NaHCO3 và Na2CO3 0,1 M (mỗi loại), ở 37oC. Chủng C22 tổng hợp và tiết pyruvate ra môi trường đạt cao nhất sau 84h nuôi cấy (51,10 g/L) khi nuôi ở bình tam giác 250 mL trong môi trường SOT có bổ sung 20% glucose, 3% NaNO3, nồng độ đệm NaHCO3 và Na2CO3 0,2 M (mỗi loại), ở 37oC.

- Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ glucose trong khoảng từ 10-25% cho thấy: Chủng BL6 sinh trưởng đạt cao nhất khi môi trường được bổ sung 10% glucose (8,56 g sinh khối khô/L sau 60 h nuôi cấy. Tuy nhiên, khi tăng nồng độ glucose 10-20%, sinh trưởng của chủng này giảm nhẹ và bị ức chế khi bổ sung glucose với nồng độ 25%. Ngược lại hàm lượng pyruvate được tiết ra môi trường nuôi cấy lại có xu hướng tăng khi tăng nồng độ glucose 10-20%. Hàm lượng pyruvate cao nhất đạt 49,76 g/L sau 72h nuôi cấy trong môi trường có bổ sung 20% glucose. Giá trị này cao hơn 1,9-2,5 lần so với khi bổ sung 15% và 10% glucose, tương ứng. Cũng tương tự như chủng BL6, chủng C22 sinh trưởng có xu hướng giảm nhưng hàm lượng pyruvate lại có chiều hướng tăng lên khi tăng nồng độ glucose từ 10-20%. Ở nồng độ 25% glucose, sinh trưởng của chủng C22 cũng bị ức chế. Sinh trưởng của chủng này đạt sau 72 h nuôi cấy trong môi trường có bổ sung 20% glucose (đạt 7,52 g/L), trong khi hàm lượng pyruvate đạt 51,10 g/L sau 84 h nuôi cấy. Giá trị này cao hơn 1,4-2,6 lần so với khi bổ sung 15% và 10% glucose, tương ứng.

- Đã chọn được loài rong lục U. reticulata có hàm lượng carbohydrate cao nhất trong số 3 loài rong đã thu thập là U. intestialis, U. lactuca và U. reticulate đạt 65,5% khối lượng khô- KLK) phù hợp làm nguyên liệu để sản xuất nguồn carbon trong nuôi trồng Halomonas.

- Đã xác định được điều kiện để thủy phân rong U. reticulata bằng axit và bằng bằng enzyme Viscozyme L. Nhóm đề tài đã lựa chọn 24h là thời gian tối ưu cho việc xử lý bằng enzyme. Các đường đơn có mặt trong dịch thủy phân rong cũng đã được phân tích bằng HPLC với 46,2% glucose và 24% xylose.

- Hàm lượng pyruvate và sinh trưởng đều đạt cực đại sau 72 h nuôi cấy trong môi trường nuôi có bổ sung 15% dịch thủy phân rong Ulva cũng như 15% glucose tinh khiết. Tuy nhiên, cả sinh trưởng và hàm lượng pyruvate của chủng BL6 khi nuôi trong môi trường có bổ sung 15% dịch thủy phân rong Ulva đều đạt cao hơn so với glucose tinh khiết như sau: với 15% glucose, sinh trưởng đạt giá trị OD600 nm là 8,35 sau 60 h nuôi cấy; hàm lượng pyruvate đạt 25,67 g/L sau 72 h nuôi cấy trong khi đó sinh trưởng đạt giá trị OD600 nm-16,37; hàm lượng pyruvate- 55,23 g/L. Điều này có thể là do trong dịch thủy phân rong ngoài glucose còn có xylose và các hợp chất khác - những hợp chất mà chủng BL6 vẫn có thể sử dụng đồng thời cũng với glucose để duy trì mức sinh trưởng và hàm lượng pyruvate cao.

Các kết quả của nghiên cứu đã được công bố trên tạp chí Journal of Applied Phycology, Archives of Microbiology, Academia Journal of Biology và Tạp chí Sinh học.

Có thể tìm đọc toàn văn Báo cáo kết quả nghiên cứu của Đề tài (Mã số 17354/2020) tại Cục Thông tin khoa học và công nghệ quốc gia.

P.T.T (NASATI)