Nghiên cứu metagenome của vi sinh vật đất vùng rễ một số cây trồng ở Việt Nam: Cây thuốc có củ (cây nghệ), cây công nghiệp (cà phê) nhằm tăng năng suất và chất lượng cây trồng

Hải miên là nhóm quan trọng của Metazoa và hải miên biển là một thành phần đa dạng cao và quan trọng của quần thể sinh vật đáy biển, từ cửa sông, bờ biển đến biển sâu. Hải miên là một trong những nguồn các hợp chất hoạt tính sinh học từ biển nổi bật nhất, với khoảng 4851 hợp chất (năm 2014), đóng góp gần 30% tổng số các hợp chất tự nhiên từ biển được phát hiện. Trong 10 năm từ 2001 đến 2010, hơn 2400 các sản phẩm tự nhiên mới được phát hiện từ 542 chi và 671 loài hải miên. Rất nhiều hợp chất nhận được từ hải miên, gồm terpenoids, alkaloids, peptides, và polyketides...và chúng có nhiều ứng dụng tiềm năng trong công nghệ sinh học, được sử dụng như các chất kháng sinh, kháng ung thư, kháng virus, chống viêm và chống độc.Do sự tương đồng cao của một số hợp chất nhận được từ hải miên với các chất trao đổi thứ cấp của vi sinh vật đã biết, người ta tin rằng ít nhất một số cơ chất hoạt tính sinh học là do vi sinh vật liên kết sản sinh. Ngoài ra, nguồn gốc của các sản phẩm tự nhiên phân lập từ hải miên có mối liên kết với vi sinh vật liên kết không nuôi cấy bằng cách phát hiện các nhóm gen sinh tổng hợp các chất trao đổi thứ cấp tương ứng. Hải miên có cộng đồng vi sinh vật liên kết đa dạng và phong phú. Sự đa dạng này có thể giải thích một phần bởi sự thay đổi các điều kiện lý, hóa, sinh trong hải miên, có thể ảnh hưởng đến sinh thái vi sinh vật và tiến hóa. Vi sinh vật liên kết với hải miên có cả nội bào và ngoại bào. Chức năng liên kết của vi khuẩn liên kết với hải miên gồm thu dinh dưỡng, ổn định khung hải miên, xử lý (processing) chất thải trao đổi chất và sản sinh các chất trao đổi thứ cấp.

Trong những năm gần đây, Việt Nam đã xúc tiến một số chương trình nghiên cứu và giám sát đa dạng sinh học động vật biển. Những nghiên cứu tách chiết các chất có hoạt tính sinh học từ động vật biển như hải miên, san hô mềm...cũng được tiến hành tại một số cơ sở nghiên cứu. Tuy nhiên, các nghiên cứu về hải miên tại Việt Nam còn hạn chế và chưa có nghiên cứu nào về hệ vi sinh vật liên kết hải miên cũng như phát hiện các chất có hoạt tính sinh học từ hệ vi sinh vật này, đặc biệt là việc sử dụng kỹ thuật metagenomics để phát hiện và sàng lọc các gen có hoạt tính sinh học từ nguồn môi trường tiềm năng này. Nhằm có thể đánh giá sự đa dạng vi sinh vật liên kết với một số loài hải miên biển tại Việt Nam thông qua kỹ thuật metagenomics, phát hiện các gen mã hóa cho các sản phẩm tự nhiên có hoạt tính sinh học và tìm hiểu khả năng khai thác các gen này, đồng thời thu nhận một số hợp chất có hoạt tính sinh học và xác định tính chất của chúng, nhóm đề tài Viện Hoá sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam do PGS. TS. Nguyễn Thị Kim Cúc đứng đầu đã tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu Metagenome của vi sinh vật liên kết hải miên tại biển miền Trung Việt Nam nhằm phát hiện và sàng lọc các chất hoạt tính sinh học mới”.

Sau gần 4 năm thực hiện (T7/2014 - T11/2018, nhóm đề tài đã thu được kết quả như sau:

1. Đã thu được 44 mẫu hải miên (Quảng Trị: 13 mẫu; Đà Nẵng: 20 mẫu và Nha Trang: 11 mẫu) và định danh được 27 mẫu (Quảng Trị: 6 mẫu; Đà Nẵng: 11 mẫu và Nha Trang: 10 mẫu) dựa trên phân tích trình tự gen 18S rRNA.

2. Đã giải trình tự metagenome của 3 mẫu hải miên đại diện cho 3 miền (DN9, QT2 và NT16) trên hệ MySeq. Dữ liệu của mẫu DN9 ˃ 3 Gb; mẫu NT16 ˃ 2,2 Gb và mẫu QT2 ˃ 4 Gb.

3. Đã xây dựng được cơ sở dữ liệu metagenome cho 3 mẫu hải miên. Tổng kích thước hệ gen của mẫu DN9 là 321 Mb; NT16 là 311 Mb và QT2 là 418 Mb. Lắp ráp các reads thành contigs và dự đoán gen (số lượng contigs của các mẫu hải miên DN9, NT16 và QT2 lần lượt là 79.743, 98.706, 102.236 và tổng số lượng gen dự đoán của các mẫu trên tương ứng 290.677, 290.874 và 372.732 gen); xác định tình trạng của gen và chức năng gen dựa trên các cơ sở dữ liệu khác nhau. Tìm kiếm các gen có liên quan đến hoạt tính ức chế protease và vi sinh vật kiểm định. Sơ bộ phân loại các gen dự đoán vào ngành và lớp vi sinh vật.

4. Đã xác định được sự đa dạng của vi sinh vật liên kết hải miên thu thập từ Đà Nẵng, Nha Trang và Quảng Trị dựa trên phân tích trình tự vùng siêu biến V4 gene 16S rRNA. Nhìn chung, các mẫu hải miên đều có các ngành, lớp, bộ, họ chính giống nhau, nhưng mức độ phong phú của chúng đối với mỗi mẫu hải miên khác nhau. Đã phát hiện được ngành đặc hiệu cho hải miên DN9 là Cyanobacteria và NT16 là các ngành Fimicutes, Planctomycetes và Verrucomicrobia.

5. Đã xác định được 8 gen đại diện có hoạt tính sinh học mới (so với ở Việt Nam) và 10 OTU phân loại vi sinh vật mới.

6. Đã biểu hiện 2 gen PKS-02690 và NRPS-0883 trong hệ E.coli , sản phẩm nhận được dưới dạng inclusion bodies. Đã biểu hiện gen PI-QT trong E.coli và tìm được điều kiện thích hợp để thu được protein tan nhiều nhất. Đã xác định hoạt tính và các tính chất của protein biểu hiện. Đã biểu hiện gen PI-QT trong P.pastoris và tìm được điều kiện thích hợp để thu được protein nhiều nhất. Đã xác định hoạt tính và các tính chất của protein biểu hiện.

7. Đã thu hồi được 5,6 mg protein PI-QT biểu hiện, tinh sạch và xác định thành phần. Protein tái tổ hợp có độ tinh sạch 85%. Đề tài đã tách 2 hợp chất thuộc nhóm macrolactins (A và H) từ canh trường lên men của chủng vi khuẩn Bacillus subtilis V5D3SCA liên kết với hải miên Đà Nẵng và xác định hoạt tính cũng như cấu trúc của chúng. Thu hồi được 12,4 mg macrolactin A với độ tinh sạch 98,8% và 6,4 mg Macrolactin H với độ tinh sạch 91,5%.

8. Đã xác định được giá trị MICs cho 2 hợp chất mcrolactin A và H đối với một số chủng vi sinh vật kiểm định. Protein tái tổ hợp PI-QT biểu hiện trong E.coli và P.pastoris đều có khả năng ức chế trypsin, α-chymotrypsin và thermolysin. Tuy nhiên hoạt tính ức chế đối với từng protease khác nhau.

Như vậy, đề tài đã thu được 5,6 mg protease inhibitor (PI-QT) tái tổ hợp có độ tinh sạch 99% - 6,4 mg Macrolactin H, độ tinh sạch 91,5% - 12,4 mg Macrolactin A, độ tinh sạch 98,8%. Cơ sở dữ liệu metagenome vi sinh vật liên kết 3 mẫu hải miên: ba dữ liệu metagenome, mỗi dữ liệu dung lượng lớn hơn 3 Gb. CSDL cho: DN9 321 Mb; NT16 311 Mb; QT2 418 Mb. Một bản danh sách 10 OTU phân loại vi sinh vật mới và một bảng danh sách 8 gen mới. Đã đăng ký 3 metagenome trên Ngân hàng gen Quốc tế MG-RAST. Trang web www.mg-rast.org. ID của mẫu từ: mgm4476076 đến 4476081. SPV - Spheciospongia sp. (QT2); RHG - Rhabdastrella globostellata (DN9) và CLR - Clathria reinwardti (NT16). Đã đăng ký 4 trình tự gen trên GenBank với Ass. No : MK307830; MK307831; MK307832; MK359987. Hai Qui trình biểu hiện protease inhibitor (PI-QT) trong E.coli và P.pastoris, một Qui trình biểu hiện gen thuộc nhóm PKS trong E.coli (Đã nghiệm thu cơ sở). 02 qui trình lên men tinh sạch protease inhibitor tái tổ hợp (PI-QT) và 01 qui trình tách chiết hợp chất có hoạt tính đối kháng vi sinh vật kiểm định qui mô 10 lit (Đã nghiệm thu cơ sở).

Có thể tìm đọc toàn văn Báo cáo kết quả nghiên cứu của Đề tài (Mã số 16341/2019) tại Cục Thông tin Khoa học và Công nghệ Quốc gia.